La microscopia Raman coerente potrebbe essere ampliata attraverso la fusione di strumenti e computer

20 marzo 2023

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a cura del Light Publishing Center, dell'Istituto di ottica di Changchun, della meccanica e della fisica fine, CAS

Lo scattering Raman è un processo di scattering anelastico che scambia energie tra fotoni e molecole per trasportare informazioni sulle vibrazioni molecolari. La microspettroscopia Raman è diventata uno strumento analitico indispensabile in biologia e chirurgia medica soprattutto grazie ai suoi due "liberi": senza etichetta e senza fondo idrico.

Questi vantaggi ci consentono di studiare campioni viventi senza perturbazioni endogene. Inoltre, i picchi Raman hanno una larghezza di banda spettrale molto più ristretta rispetto allo spettro di emissione dei coloranti fluorescenti, il che consente lo studio simultaneo di varie specie metaboliche nello stesso ambiente.

In un nuovo articolo pubblicato su eLight, il dottor Haonan Lin e il professor Ji-Xin Cheng dell'Università di Boston hanno esaminato la combinazione di strumentazione e approcci computazionali allo scattering Raman coerente (CRS).

Nonostante i suoi vantaggi significativi, uno svantaggio fondamentale dello scattering Raman risiede nelle sue sezioni trasversali fortemente limitate. Una tipica sezione trasversale Raman è di 10-30 cm2 per molecola, il che si traduce in un tempo di integrazione del segnale molto lungo, da secondi a minuti per macchia focale. Una velocità così limitata rende poco pratico eseguire l'imaging pixel per pixel di sistemi dinamici. È stato introdotto un processo ottico non lineare per migliorare i segnali Raman in modo coerente e per rompere i limiti fondamentali della sezione trasversale.

Con due laser ultraveloci sincronizzati, i segnali Raman coerenti sono emersi nello scattering Raman anti-Stokes coerente (CARS) e nello scattering Raman stimolato (SRS). Nella CRS, due campi laser interagiscono in modo sincrono con la molecola bersaglio. Quando la frequenza di battito corrisponde alla modalità vibrazionale Raman, si verifica un processo di trasferimento di energia amplificato in modo coerente. Annichila il fotone della pompa, lo converte nel raggio di Stokes e genera fotoni ad una nuova frequenza.

CRS ha consentito l'imaging chimico ad alta velocità basato su picchi Raman intrinseci su campioni biologici. Tuttavia, i campioni biologici sono microsistemi sofisticati costituiti da vari metaboliti che spesso presentano sovrapposizioni spettrali, soprattutto nella regione forte ma affollata di carbonio-idrogeno (CH).

Ostacola la quantificazione e l'identificazione di sostanze chimiche nelle cellule e nei tessuti utilizzando CRS monocolore a banda stretta. Negli ultimi anni sono stati compiuti sforzi significativi per sviluppare un CRS iperspettrale che produca uno spettro Raman per ciascun pixel.

L'immagine iperspettrale offre il potenziale per decifrare le informazioni sulle composizioni chimiche e sull'abbondanza in un ambiente complesso. Tuttavia, a causa dell'elevata dimensionalità dell'immagine grezza, tali informazioni non sono immediatamente disponibili. Sono necessari algoritmi per identificare i principali componenti puri e scomporre le mappe di concentrazione.

Parallelamente agli sviluppi della strumentazione nel CRS iperspettrale, sono stati segnalati vari metodi di separazione delle immagini iperspettrali. A seconda che vengano fornite informazioni preliminari sulla composizione dei componenti puri, li classifichiamo in metodi supervisionati o non supervisionati.

Le innovazioni della strumentazione hanno spinto l'imaging CRS a velocità di frame rate fino a 2 kHz, copertura spettrale fino a 3500 cm-1 e velocità di acquisizione spettrale fino a 5 µs per spettro. Tuttavia, queste condizioni non possono essere realizzate contemporaneamente a causa del limite fisico determinato dal limite di sensibilità del CRS.

Ad esempio, un ulteriore aumento della velocità deteriorerà il rapporto segnale-rumore (SNR) della configurazione, rendendola inapplicabile alle applicazioni biomediche. Sotto il vincolo del fotodanneggiamento, questo compromesso può essere trasmesso come uno spazio di progettazione. È un iperpiano che si interseca con tre assi che rappresentano velocità, larghezza di banda spettrale e SNR. L’ottimizzazione della strumentazione consente al sistema di raggiungere un punto di condizione ottimale sull’iperpiano, ma andare oltre rimane una sfida.